高精度の 【データ】 を得るためのサンプル撮影 FUSION - Chemiluminescence Imaging System

ウェスタンブロットの撮影結果に対しては、ダイナミックレンジを広く使用することが望ましい
という話を ”こちら” に記載しました。

本ページでは、CCDイメージングシステムでダイナミックレンジを広く使用した撮影する為のコツについてご紹介致します。

サンプルと CCDセンサーの距離について

ダイナミックレンジを広く使用した撮影を行う為には、物理的に CCDイメージングシステムにて検出される光量を多くする必要があります。
その為には、ウェスタンブロットサンプルと CCDセンサーとの距離が重要になります。


光は移動した距離の二乗に反比例して減衰する性質を持ちます。 ウェスタンブロットサンプルと CCDセンサー部の距離が2倍離れた場合、4倍の感度差が生じます。ウェスタンブロットサンプルは可能な限り、CCDセンサーに近づけて撮影を行ってください。

感度設定について

CCDイメージングシステムでは、感度設定の変更が可能です。
一般的に CCDイメージングシステムでは、複数の画素をまとめて1つのピクセルとして出力する Binning という処理を行うことが出来ます。


Binning 無しの図では、16個のピクセルを持ちますが、個々のピクセルのもつシグナル値は低くなっています。
Binning 2x2 の処理を行うと、ピクセル数は 1/4になりますが、シグナル強度は各4つのピクセルの合計値となります。
このように Binning 処理により解像度を犠牲にして、感度を上げることが可能です。

露光時間の調整のみで適切な画像の取得が難しい場合は、Binning 設定の変更を試みることができます。

撮影モードについて

一般的な CCDイメージングシステムには以下の三つの撮影モードがあります。
・マニュアルモード
・連続積算モード
・自動露光モード


いずれの撮影モードも、サンプル撮影の露光時間を調整する為のものです。
上記の内、自動露光モードは比較的、新しい撮影装置に搭載されています。


ケミルミ反応は経時的に発光強度が変化します。
発光試薬をサンプルに添加してから、撮影可能な時間は限られている為、適切な撮影モードを用いて望ましい撮影が得られる露光時間に調整を行う必要があります。

・マニュアルモード

マニュアルモードは、 X線フィルムを用いた場合と同様に、任意の露光時間で撮影することができます。

このモードでの撮影は、設定を簡単に行うことができますが、適切な露光時間の条件検討を幾度か行う必要があります。後述する、撮影によるバックグラウンドの上昇なく撮影をすることができますが、発光強度の予測がつかないようなサンプルの場合は、露光時間調整が難しい撮影モードです。

・連続積算モード

連続積算モードは、1枚のサンプルに対して複数回撮影を行い、その撮影結果を積算していきます。


一度の撮影で、シグナル強度が弱い (積算回数が少ない) 画像から、強い (積算回数が多い) 画像まで取得することが可能です。
その為、複数枚出力された画像の中から、最も適切な画像を選択することが可能です。

条件検討の必要がなく、十分にシグナルを取り込んだ画像の撮影が可能な撮影モードです。

連続積算モードでの撮影の欠点は、連続積算の回数が増える程、撮影装置由来のノイズも画像に積算されていくことです。


積算回数が多すぎると、薄いバンドが積算されたノイズに埋もれて検出できなくなり、定量の精度が低下するという危険性があります。

連続積算モードでは、出来る限り少ない回数での撮影が推奨されます。

・自動露光モード

自動露光モードは、短時間のテスト露光にて得られたシグナル値から、最もダイナミックレンジを広く使用した撮影データを得る為の露光時間が自動的に算出されます。


撮影自体は一回のみ行われる為、連続積算モードで見られたようなノイズの上昇は無く、マニュアルモードのように条件検討を行う必要がない為、最も簡単かつダイナミックレンジを広く使用した撮影を行うことが可能なモードです。

ただ、短時間のテスト露光で得られたシグナル値を元に露光時間を算出する為、FUSION のような高い感度を持つイメージングシステムでないと適切な露光条件の算出が難しくなります。
また、明るすぎる、もしくは極めて微弱な光しか出さないサンプルなどにおいては、正確な露光時間予測が出来ないケースもあります。

・推奨する撮影モード

初めて撮影するサンプルの場合は、自動露光モードで撮影することを オススメ します。感度に問題がないサンプルであれば、低ノイズでバンドの量を正しく反映した画像を撮影することが出来ます。

自動露光モードで撮影することが難しいサンプルや明るすぎるサンプルの場合はマニュアルモードを推奨します。 また、極めて微弱な光しか出さないサンプルの場合は連続積算モードにて適切な露光条件を検討することを推奨します。

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